宫颈癌疫苗是怎样“炼”成的

周健是恢复高考后的首届大学生。1982年下半年即将毕业时，同学们都等待分配工作，可他是另类，积极忙于备考研究生。在温州大冷的天夜晚，一盆刺骨的冰水放在身边，看书疲倦时双脚就往里伸一伸，用来清醒头脑。周健“冰水泡脚”的故事和古代“悬梁刺股”典故，堪称刻苦读书典范。当年底他顺利地考入了浙江医科大学病理系攻读硕士学位。

▲温医大七七级临床医学二班全体同学合影

导师徐英含是著名的病理学教授，所以周健的研究方向也是病理学，课题为“铅离子在体外对肺巨噬细胞免疫功能的影响”。当周健正在对该课题深入研究的时候，医学界已将宫颈癌HeLa细胞作为工具，广泛应用于肿瘤研究。楚尔·豪森也在用HeLa细胞研究人乳头状瘤病毒（HPV）与宫颈癌之间的关系。周健用肺泡巨噬细胞（PAM）和HeLa细胞采用不同的比例进行混合培养，观察两种细胞的相互作用，包括形态变化和细胞毒作用等。

在做细胞培养期间，他如痴如醉，起早贪黑。连未婚妻孙小依也经常被搭上，从医院下班后就骑上自行车直奔他的实验室当助手，帮他培养细胞、洗实验玻璃器皿、做观察记录。甚至在结婚的那天，母亲在家备好了喜宴，亲朋好友都已到齐，可是新郎周健还在实验室，使喜宴好久不能开席。母亲问他“为什么这么晚才回来，让大家都等你？”周健回答道：“手上细胞培养的活儿要做完，否则会前功尽弃”。徐英含教授这样回忆道：“我每天都要查他们的实验记录，周健的实验记录非常详实，以日志的形式逐日把当天的工作记下，既记实验成功的数据，也记录失败和与预期不符的数据，只有这样才能改进实验，最后完成实验。他的实验记录完整清晰。在科研工作中必须勤奋，周健在我这里，整整三年，不分寒暑假，不分日夜。工作起来，一竿子到底，做好为止。有时因为细胞培养需要，不仅白天要在实验室观察，连晚上也要进行观察。周健正是这样在实验室度过了许许多多个夜晚。”

经过周健的艰辛努力，实验终于得出“PAM对HeLa细胞生长的抑制是非常明显的”的结论。他的研究文章分别发表于美国权威杂志Toxicology and Applied Pharmacology和《中华劳动卫生职业病杂志》、《浙江医科大学学报》上，研究成果也获得浙江省科技进步一等奖。

1985年12月 ，周健又考入河南医科大学，师从著名的病理学家、我国食管癌防治研究先驱沈琼教授攻读博士学位。当时父母都已年迈，特别是父亲，五十得子，希望儿子能在杭州找一份安稳的工作，陪伴着父母。可是，此时的周健已决意继续在科研的道路上勇攀高峰，并致力于人乳头状瘤病毒的研究。

在确定食管癌与HPV之间关系的研究方法时，周健的设想是：打破导师传统的形态病理学的研究方法，开创用分子生物学技术研究人乳头瘤病毒的新路子。这时，周健没想到自己的设想马上得到了导师沈琼教授的认可并大力支持，还即时帮助周健联系国内实验条件最好的中国疾病控制中心病毒所去做实验，并落实了病毒所谷淑燕教授为周健的指导老师。

在病毒所期间，周建得到了谷淑燕教授的精心指导。她为周健提供了HPV6、11、16、18多个型别的人乳头瘤病毒DNA样本，还将自己刚从德国带回的HPV研究培训教材给周健。周健非常珍惜这个机会，以培训教材为基础，多方位地开展了HPV的研究，采用基因工程、分子生物学等方法，对HPV的检测和表达及DNA序列的研究，积累了大量的研究数据资料和方法。回到河南医科大学后，又通过在实验室日日夜夜苦战，在1986年12月得到食道癌活检标本“在其中25例中发现了人乳头状瘤病毒，占送检标本中的27%，其中一例为食道下段腺癌，其余24例为鳞癌”。周健在国内首次从食道组织中测出人乳头状瘤病毒，是食道癌病因研究的重大突破。他分别发表了《间接杂交方法在食管癌标本中人乳头瘤病毒的检测和表达》、《牛痘病毒载体的HPV18载体基因在综合细胞中的表达》和《食管癌标本中人乳头状瘤病毒（HPV）DNA序列的检测》等文章，他的研究成果获国家科技进步二等奖。1987年2月2日《人民日报》在头版、《中央人民广播电台》新闻联播节目等媒体都相继报道了他的研究成果。

楚尔·豪森证明了人乳头状瘤病毒（HPV）会导致宫颈癌后，全世界许多科学家都在试图发明一种疫苗以预防人乳头状瘤病毒感染，避免妇女因宫颈癌而死亡。

周健是众多研究HPV科学家中的一位。1988年5月周健拿到博士学位后，又投身于北京医科大学博士后流动站，在张迺蘅教授指导下继续HPV研究。1989年周健有幸赴剑桥大学的帝国癌症研究基金会（ICRF）肿瘤与病毒实验室继续HPV研究工作。

人乳头瘤病毒是一种无外膜包裹、20面体的小DNA病毒，直径只有52-55纳米。基因组由闭合环状双链DNA链分子构成，蛋白由L1、L2、E1、E2、E4、E5、E6、E7等组成， L1、L2分别为HPV主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。用当时实验室的标准方法，无法培养及获得HPV病毒，更谈不上制备疫苗。此外人们已经发现HPV有几十种亚型，选哪一种HPV亚型以及采用什么样的方法获取病毒等问题一直困扰着周健。

在剑桥ICRF实验室Crawford教授的指导下，他决定从HPV 16入手，采用牛痘病毒体外表达系统，开展HPV 16 L1、L2基因克隆、重组和表达。

▲周健夫妇在剑桥ICRF实验室

期间，周健已将妻子孙小依申请到自己身边当助手。研究进展也很顺利，并取得了非常重大的突破。首先HPV 16 主要衣壳蛋白L1和次要蛋白L2从病毒DNA中克隆出来，研究L1基因和L2基因从不同启动子表达的结果。 使这两个宫颈癌疫苗关键蛋白的表达成为可能。他们还利用这一表达系统，在世界上首次研究了机体对L1蛋白产生的细胞毒用。

HPV领域著名病毒学家玛格丽特 • 斯坦利认为：“周健非常擅长于培养重组痘苗病毒，他着手确定不同的点位，可以将相关的基因加入到痘苗病毒基因组中，目标是提高蛋白的表达。他将L1基因加入到痘苗蛋白酶抑制剂基因位点，然后用霉酚酸来挑选重组病毒。这是一种创新的方法，提高了加入的基因的表达和蛋白的水平。”

在当年寄回家的录音带中，周健说：“现在两个人在这里都很忙，为啥呢？两个人都在一个实验室，上班下班一道，晚饭吃好还要再去做一会儿，所以工作上安排有啥事情有点空都去做”。孙小依接着：“做实验也不是为了老板做，主要为自己，多做多出点文章。想想机会很不容易，现在两个人一道做一个课题，老板出钱，我们做，做出来文章还是归自己的，所以我们两个人很卖力的。在实验室里上次我也跟周健开玩笑，我是泥水匠啰，打小工的。周健是设计师，设计出来我来做，我相当于他的一个技术员，随便什么都帮他做。当然如果用另外技术员没这么卖力帮他做”。

Crawford教授回忆道：在剑桥时周健博士研究的“乳头状瘤病毒衣壳蛋白表达的工作进展良好，我们很快就进入了在疫苗系统中加入HPV L1衣壳蛋白和L2衣壳蛋白的工作。小白鼠实验结果良好，表明该蛋白具有抗原性”。

与周健同一实验室的约翰.杜巴博士回忆说：“我记得在90年代早期的一个晚上，Lionel Crawford出现在英国电视台上，宣告我们将在五年的时间里研制出抗人类乳头状瘤病毒的疫苗。这项宣告是建立在研究者周健的决心和他出色的技术技巧上的。而如今我们已是硕果累累！周健是这项成果的开创者和奠基人。”

当周健夫妇在研究HPV领域不断获得进展的时候，引起了多个国家的研究机构关注，纷纷邀请周健夫妇加入他们的团队。更引起了正在剑桥学术休假的弗雷泽教授的兴趣。

弗雷泽，1985年取得博士学位后，前往昆士兰大学从事HPV免疫学研究，但几年过去了，进展缓慢。他想学习分子生物学，试图在细胞中表达HPV蛋白，于是于1989年来到了剑桥大学。弗雷泽所在实验室，正好与周健所在实验室紧挨着。由于周健的实验室主要研究HPV，弗雷泽有事没事就过来偷师学艺。他遇到基因克隆的问题就过去请教周健，周健总能帮忙解决问题。

两人常常利用喝咖啡的时间，交流各自的想法，惊叹彼此有着共同的话题和共同的兴趣。对于未来，他们甚至谈到可以通过合作来验证一些新想法。弗雷泽说：“如果宫颈癌是由HPV感染致癌的，那么我们是否可以开发疫苗来预防这种癌症呢？”由于通过近距离接触和了解，发现周健的研究方法才是正确的方向，于是弗雷泽在学术休假结束前夕，对周健说：“我邀请你和孙小依到澳大利亚昆士兰大学一起工作。我有一个实验室，并且我已经申请到很多经费，有条件对HPV进行深入研究。”

▲周健博士（右）与弗雷泽教授

在弗雷泽教授的力邀下，周健于1990年2月份开始申请赴澳，8月获得澳大利亚的签证。周健夫妇于当年8月28日离开剑桥，途经香港，花了两天半时间到了昆士兰，弗雷泽亲自从机场将他俩接上后，安顿在了昆士兰大学招待所。由于规定可以免费住宿两天，周健顾不上旅途疲惫，首先要租房子把家安顿下来，然后马上就着手实验室的筹备。当时他俩给家里信中写道 ：

“实验室，位于布里斯本的一个大医院内，属昆士兰大学。实验条件没有英国剑桥大学的好”。“从事的分子生物学属这儿新开科目，万事开头难，花了很多精力购置设备上。况且服务设施不好，好多液体不是现成的，要自己动手制备。订一些实验试剂要通过医院系统，效率不高。往往订出一样试剂要等一个月。不像在剑桥时，今天订明天就到货。所以，忙忙碌碌都不出结果”。

“做分子生物学的工作，没有人一起商讨”。那时弗雷泽教授对分子生物学还不是很懂。

周健在剑桥期间已证明HPV L1和L2衣壳蛋白有抗原性，现在试着用不同的方法，继续研究L1和L2在体外的表达和免疫原性。由于这是一项非常巨大的技术挑战，所以时间过去几个月不见成果，加上经济收入比剑桥少许多，使周健产生过离开昆士兰的念头。

但机遇往往会在困境中出现。周健和孙小依一天晚饭后散步时，周健突然想到了一个简单的方法，能否将自己克隆的PV L1和L2两种衣壳蛋白人一起在体外用重组痘苗病毒表达，研究是否用这种方法体外表达L1和L2，看它们是否可以在体外形成病毒样颗粒？

此时的妻子助手孙小依觉得如用这么简单的方法，人家早就做成功了。在周健的催促下，孙小依将PV L1和L2进行了组装实验。几天后，电子显微镜下观察时, 惊喜地发现了病毒样颗粒。

“1991年3月, 也就是周健到达布里斯本六个月之后, 在他们共同努力下, 研究小组被这一实验结果震惊了。”弗雷泽说。

周健从实验中发现了HPV L1、L2衣壳蛋白具有自我组装的功能，可形成病毒样颗粒（VLPs）,与天然的病毒颗粒具有相似的结构，且有很强的免疫原性和免疫综合性，有可能可以预防HPV感染。

宫颈癌疫苗“周颗粒”就这样产生了。

随后，周健、孙小依、大维·斯蒂泽尔和伊恩·弗雷泽将题为“通过在上皮细胞中表达重组L1和L2 蛋白成功组装HPV病毒样颗粒”的论文发表于1991年第185期《病毒学》杂志上。

1991年昆士兰大学为这项发明成果申请了专利。

1993年VLPs免疫原性在动物实验中被证明有效。

1994年昆士兰大学的Uniquest公司将周健和弗雷泽的VLPs疫苗专利部分出售给了CSL和Merck医药公司。

2006年7月美国FDA批准默沙东公司生产的“佳达修”四价宫颈癌疫苗上市。

2015年6月由周健和合作者发明的宫颈癌疫苗获欧洲“最受欢迎发明奖”。

2016年“佳达修”在中国使用。

不幸的是，周健博士于1999年3月9日因长期超负荷工作，过度劳累，在回国访问时，患急性感染性休克，英年早逝，年仅42岁。

宫颈癌疫苗的发明，给妇女带来光明。周健博士是该疫苗的主要发明者，正如合作伙伴弗雷泽教授在不同刊物及发言中所说的：

“如果没有周健博士的贡献这项历史性突破是无法完成的（ 2006年8月29日《昆士兰邮报》）”。

“周健承认我是他所强调的那种善于经营的科学家，我则意识到他是一位潜在的好朋友和有实力的好同事”。（《英才济苍生》p281）

“我由衷地感到高兴，周健和孙小依在完成与剑桥大学的合约之后，能接受我的邀请来布里斯本工作。我同时发现，他来澳之际，英语已讲得非常流利，而我的学生则说我的英语进步不快。Crawford教授很后悔放周健来澳大利亚。周健能举家迁来，这是我一生中之最佳决策。” （《英才济苍生》p282）

“我是一个研究病毒的免疫学家，我的目的是研究人体是怎样对抗病毒的。而周健是一个分子病毒学家，他的研究领域在于病毒是怎样作用于人体的”。（2019年1月21日人民网盛楚宜采访弗雷泽教授）

“周健试着用不同的方法，即用病毒外壳结构蛋白质去研究病毒感染的免疫反应，他发明了这种病毒外壳蛋白人工合成了病毒样颗粒。”（《英才济苍生》p172）

“在乳头瘤病毒学研究中，他首先提出了病毒样颗粒的产生及其概念。目前，在世界范围内已将这一成果应用于临床实验。这是一种大有潜力的疫苗，可预防宫颈癌的发生。” （《英才济苍生》p282）

今天缅怀周健博士，应该学习他对科学的不懈追求的精神，牢记他在分子生物学、病毒学及免疫学等领域以及为人类健康事业所做出的巨大贡献。感谢他发明了宫颈癌疫苗，使全球妇女可以免受宫颈癌病患的痛苦。

世界不会忘记你，周健！