原名：Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer
译名：单核RNA测序和深层组织蛋白质组学揭示了I期和II期宫颈癌中独特的肿瘤微环境
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
通讯作者单位：澳大利亚阳光海岸大学；佛山市第一人民医院；
1. 鉴定I期和II期宫颈癌的肿瘤细胞组成
我们分别从宫颈癌I期（n = 4）和II期（n = 3）肿瘤组织中分离的所有细胞核进行了snRNA-seq实验（图1A），质量控制后共有72128个（42928个I期和29200个II期）细胞核用于下游分析（图1B和补充图1）。无监督聚类分析揭示了22种细胞类型，它们均存在于I期和II期中，表明细胞类型不受衰老和分期效应的影响（图1B，补充图2A和2B）。通过比较两个阶段不同细胞类型的比例，发现CCII组中3、4、9、14、15、16、17、18、19细胞群的百分比在大幅上升，而2、5、7和20细胞群的比例则有所下降（图1C和补充表1）。在0和3细胞簇中，许多细胞未表现出明确细胞周期标记基因的差异表达（图1D）。细胞簇1、2和5中S或G1细胞周期的细胞数量较多，而细胞簇 7和细胞簇 8中S和M期的细胞数量较多（补充图3A和3B）。CCI-4、CCII-2和CCII-3中非周期细胞比例较高，而其他三个CCI样品中G1和S期细胞比例较高（补充图3C和3D）。
我们分析差异表达基因（DEGs）以确定细胞类型特异性标记基因（图1E和补充表2），对22个细胞簇的相关性分析表明，细胞簇 17与其他聚类的相关性最小，其次是细胞簇 13，说明这两个聚类中存在不同的表型（补充图4）。与免疫反应直接相关的细胞类型包括T细胞（细胞簇 4；标志基因：NELL2，ITK和 IL7R），巨噬细胞（细胞簇 6；标志基因：SIGLEC1，FPR3和MSR1），γδT细胞（细胞簇 8：TOP2A，ASPM和CENPF），Naive B 细胞（细胞簇 9：DCC，CD38，POU2AF1），调节性T细胞（Treg，细胞簇 10：CTLA4，IL2RA和F5），NK细胞（细胞簇 11：KLRC1，GNLY和NCR1），CD141+CLEC9A+DC（细胞簇 16：SLC24A4，FLT3和ZNF366）和浆细胞样树突状细胞（pDCs，细胞簇 21：CLEC4C，IL3RA和IRF8）。一些细胞簇具有干细胞的特征，包括肿瘤干细胞（CSCs） （细胞簇 0：CLDN10-AS1，TOX3和PROM1），间充质干细胞（细胞簇 3：ADAMTS2，LAMA2和ABI3BP），血管干细胞（VSCs）（细胞簇 7：RRM2, EXO1和SKA3）和内皮细胞/颌下腺干细胞（细胞簇 12：FLT1，PCDH17和VWF）。两个细胞簇被注释为祖细胞，即神经祖细胞（NPCs, 细胞簇 19：NRXN1, ADAMTSL1和PPP2R2B）和粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPCs，细胞簇 20：CPA3, MS4A2和 TPSAB1）。细胞簇 1主要富含基底层细胞，KRT15、KRT17和KRT5显著高表达。上皮细胞和淋巴内皮细胞主要分布在细胞簇 2（IL1RN, GPRC5A和 SPRR1B）和细胞簇 18（FLT4, PROX1和CD34）。此外，还包括脂肪来源的基质细胞（细胞簇 5：NTRK2, PTPRZ1和CHL1），肌成纤维细胞（细胞簇 13：SPARC， COL1A1和COL6A2），周细胞（细胞簇 15：RGS5，ABCC9和ADGRF5）和星形胶质细胞（细胞簇 17：FOSB，ATF3和ITGB4）。
图1. 宫颈癌I期和II期患者肿瘤组织的snRNA-seq分析
（A）实验设计：肿瘤组织取自广东药科大学附属第一医院。（B）通过t分布-随机近邻嵌入（t-SNE）降维算法，分析CCI和CCII患者TME提取的单个细胞核中基因表达数据，可以划分为22个不同的细胞簇。（C）22个细胞簇在CCI组和CCII组中的比例。（D）细胞周期不同阶段在t-SNE空间的分布。（E）选择每个聚类中用于生物学鉴定的富集基因，以及每个聚类中DEGs值最高的5个基因。MΦ，巨噬细胞；Treg细胞，调节性T细胞；NK细胞，自然杀伤细胞；NPC，神经祖细胞；GMPC，粒细胞-单核细胞祖细胞；pDC，浆细胞样树突状细胞。
2. 免疫抑制和促进肿瘤生长的表型在CCII患者TME的巨噬细胞中占主导地位
在CCI（5.30%）和CCII（5.65%）患者中分别发现了相对较高的MΦs群体。基因表达分析显示，相对于CCI，CCII组中有122个上调和102个下调的DEG（图2A，完整DEGs列表详见补充表3）。CCII组MΦ标记基因的表达相对下调，例如C1QB，C1QC，STAT1和IFI44L。此外，许多趋化因子、细胞因子和白介素在CCI组中表达显著升高，包括M1型MΦs，如IL12RB1、IL2RA和IL20RB（图2B）。与免疫抑制MΦs相关的基因（CCL19和MMP11）在CCII组中升高。GSEA富集分析显示上皮-间充质转化（EMT）是CCII组中最富集的途径。CCII组中COL1A1, COL1A2, COL6A2和COL3A1等胶原蛋白家族成员表达上调，这些胶原蛋白可能与细胞外基质合成调节基因协同发挥作用以增强组织生长（图2C和2D，补充表3）。此外，在CCII组中也检测到P53通路、TNFα信号通路、NF-κB、细胞凋亡以及其他与细胞骨架发育密切相关信号通路的富集。CCI组中编码干扰素诱导蛋白的基因上调，包括IFI44L、IFIT3、IFI44、IFI35和IFIH1，导致IFN-α和IFN-β反应途径的激活（图2E）。
图2. CCI组和CCII组的MΦs显示不同的免疫应答水平
（A）聚类热图比较了CCI组和CCII组前50个DEGs的表达和相关性。（B）2D t-SNE比较了CCI和CCII组中与MΦs相关趋化因子、细胞因子和白介素信号转导基因（FC > 1.2，p< 0.05）的表达分布。（C）CCI组和CCII组的差异表达基因的GSEA分析。（D）上皮间充质转化和（E）IFN-α反应通路显著相关的基因。
我们分析了MΦ亚型，以揭示两个阶段之间细胞异质性的变化。共鉴定出5个亚型（即细胞簇 0-4），图3A比较了5种MΦ亚型中前5个标记基因的表达情况。细胞簇 0具有驻留样巨噬细胞表型，特征基因为MS4A6A、CD163和CD163L，因此称为C0-Res。细胞簇 1中的几个标记基因与肿瘤发生相关，如PARD3、EGFR和SMAD3，因此被标记为C1-TAM。第三个亚型表现出M2型 MΦ的显著上调基因，包括SLC16A10、SLC11A1和CTSL，因此我们将其命名为C2-M2。第四种亚型同时存在树突状细胞（ADAM19、HDAC9和MCOLN2）和巨噬细胞（SLC8A1、RUNX3和LCP1）的标记基因，称为C3-DC。第五种亚型有几个标记基因（SEMA3A、ESRRG和IL18），代表M1型MΦ，因此命名为C4-M1。我们对MΦ亚型的生物学进程（BPs）进行了富集（补充图5）。在C2-M2，C3-DC和C4-M1中观察到很多免疫反应相关的BPs，然而一些炎症相关的生物学仅在C4-M1中存在，如“白细胞介素21介导的信号通路”，“炎症反应”和“调节细胞因子产生”。C1-TAM中高度富集“细胞发育”和“组织生长”进程，并在CCII组中所占比例较高，而其他亚型在CCI组中更为丰富（补充图6A）。
研究发现，与免疫应答相关的DEGs在CCI组的所有亚型中均出现上调，尤其是C0-Res、C1-TAM和C2-M2（补充图6B）。比较了各亚型中与巨噬细胞功能相关的选定基因的平均表达，显示STAT1、HLA-DRB1、TMSB4X、C1QC和FGL2在CCI组的所有亚型中表达率较高（图3B）。S100A8、DUSP1、MT2A、JUNB在CCII组各亚型中平均表达量较高，但表达比例较低。与细胞增殖和细胞外基质发育相关的基因的表达，如CCN2、AEBP1、MGP和胶原蛋白家族的几个成员，在CCII所有亚型中都高表达。值得注意的是，在CCII组的C0-Res、C1-TAM和C2-M2中观察到几个编码氧化磷酸化相关的线粒体蛋白的基因上调，例如MT-CYO2、MT-CYO3、MT-ND4和MT-ND1（补充表4），这可能与肿瘤生长过程中活跃的细胞代谢有关。将MΦs投射到Monocle3定义的二维空间上进行拟时间分析以推断MΦ发展的谱系轨迹（图3C），轨迹从C0-Res和C2-M2开始，然后发展到不同的方向。一个方向通向C3-DC和C4-M1，另一个方向最终与C1-TAM相连，形成由C1-TAM、C3-DC和C4-M1组成的分支。C3-DC和C4-M1在拟时间上具有相似的发育谱系。
（A）巨噬细胞的亚型分析。鉴定出5个亚群，包括常驻样（C0-Res）、肿瘤相关巨噬细胞（C1-TAM）、M2型（C2-M2）、树突样巨噬细胞（C3-DC）和M1型（C4-M1）。（B）巨噬细胞功能相关的DEGs的平均表达比较。（C）巨噬细胞亚型拟时间轨迹分析
由此轨迹共衍生出9个状态，在State-1、State-3、State-5检测到大量的C0-Res和C2-M2细胞，而C1-TAM细胞在拟时间后期逐渐成为最大的群体（补充图6C）。C3-DC在State-2、4和9中所占比例较高。除State 9外，C0-Res、C1-TAM和C2-M2细胞相对于CCII组细胞排列更整齐。比较CCI组和CCII组各状态的DEGs（补充表4），除State -3在CCII组中CXCR4和DOCK8表达上调外，大部分状态的巨噬细胞标记基因表达比例在CCI组中较高或平均水平较高（补充图6D）。线粒体相关标记基因和几种胶原蛋白的表达沿拟时间升高，尤其是State-5、6、7、8、9（补充图6E）。
沿拟时间有四个分支。通过分析显著依赖于Branch-1的基因，我们发现State-1和state - 2细胞中免疫反应相关基因的表达上调，如CXCL9、CXCL10、IL15、IL18、DOCK8、DOCK10和STAT1（补充图7A）。CCI组State-1细胞中DOCK8、STAT1表达明显上调，IFI44L、IFI44、IFNGR2的表达上调，从而激活IFN-γ反应。在分支2方面，State-1、3、4中的许多DEGs来自CCI组，与先天免疫系统相关（补充图7B）。State-6细胞分支后抗原加工和递呈水平较低，MHC I类蛋白如HLA-A、B、C以及HLA-DQA1、HLA-DRB1、HLA-DRA下调（补充图7C）。与趋化因子产生和中性粒细胞激活相关的基因在分支后表达较高，如DENND1B、NLRP3、CD53、FGR、PTPRC、MNDA和CD58（补充图7D）。这在很大程度上反映了CCI组State-9细胞中细胞因子介导的信号通路激活；相反，ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号在CCII State-9细胞中更为明显。
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3. T细胞的功能在CCII患者的TME中受到抑制
本研究鉴定出CD8+ T、γδT和Treg三种T细胞群。CCII组CD8+ T细胞比例（12.85%）明显高于CCI组（8.58%）（补充表1）。从整个T细胞群体来看，CD8+ T和γδT细胞群体在不同阶段发生了较大的变化，前者从57% （CCI）增加到80%（CCII），而后者减少了近70%（从CCI的28%到CCII的9%）（图4A）。CCI组患者的Treg细胞数量高于CCII组（图4B）。在2D-tSNE空间中展示两组间三种T细胞种群的分布（图4C）。CD8+ T细胞分为五种主要亚型（a、b、c、d和e），其中亚型a从CCII组获得的细胞数量明显更高。CCI组有更多来自亚型b、c、d和e的细胞。我们比较了CCI组和CCII组中表征Treg细胞maker基因的表达（图4C）。CD8A和PRF1在CD8+ T的亚型-d细胞中高表达，而CD4和CTLA4主要在CCI组的Treg细胞中表达升高。IFNGR1和IFNGR2在γδT细胞中表达较多，而IFIT3在CCI组Treg细胞中表达上调。
在两组的三个T细胞群中，前100个DEGs的层次聚类如图4D所示。CCI组CD8+ T中与T细胞免疫应答激活相关的DEGs表达明显上调，如CD7、RUNX3、CD3D、CD3G、GZMB、CD8B和CCL5。在Treg细胞中也部分观察到类似情况。CCI 组γδT细胞中与干扰素反应密切相关的基因表达上调，如IFIH1、ISG15、GBP1、GBP4、GBP5、OAS1、OAS2和OAS3。值得注意的是，CCI组CD8+ T细胞和Treg细胞中与抗原提呈相关的两个基因（CD38和CD48）表达升高，而γδT细胞中表达下调。在CCII组的CD8+ T和Treg细胞中，调节补体和凝血级联、炎症的基因聚集在一起，且表达量较高。例如，S100A8、S100A9、CYBA、CD55、C3和PLAU。总之，这些结果表明，与CCI组相比，CCII组的T细胞具有更强的免疫抑制作用，尽管CD8+ T的群体明显更高。
（A）CCI组和CCII组T细胞群中CD8+、γδT和Treg细胞比例的比较。（B）患者TME中检测到的三种T细胞群的数量。（C）2D-tSNE图显示了CCI和CCII组中不同T细胞的分布，以及所选标记基因（包括CD8A、CD4、PRF1、IFIT3、IFNGR1、IFNGR1和CTLA4）的表达。（D）两组三种T细胞类型前100个DEGs的分级聚类（FC > 1.5，P-value < 0.05）。
4. CCII的TME中的B细胞和DCs表现出抑制MHCI类抗原提呈进程
CCI组的浆细胞样树突状细胞（pDC）群体较高，而CCII组的B细胞群体更丰富（图5A）。对于CD141+CLECL9A+DCs和pDCs，与抗原提呈过程相关的DEGs如HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLADPA1在CCI组中上调，而在CCII组中HLA-B、HLA-A、HLA-C和HLA-DMB的表达较高（图5B）。此外，在CCI组的pDCs中，PSMB2, PSMD14, PMSC6和PSM8de等蛋白酶体相关基因的平均表达和表达百分比方面表现得更为明显。GO-BP富集分析表明，织发育信号在CCII组的DC中被高度激活，例如“血管生成”，“血管形态发生”，“循环系统发育”和“细胞-细胞粘附” （图5C）。许多免疫应答过程在CCI组的DC中被高度激活。似乎多细胞生物过程在CCII组的CD141+CLECL9A+DC中富集，但在CCI组的pDC中被显著抑制。通过比较MHC I类抗原提呈相关的DEG的表达，发现它们在CCI组B细胞中上调（图5D）。COL3A1、COLA1和COLA2在CCII组的天然B细胞中表达上调（图5E）。与I型和II型干扰素信号传导相关的两组基因在CCI组的B细胞中上调，如STAT1、OAS1、OAS2、ISG15、HLA-DPA1、IL12RB2和JAK2。IL-18和趋化因子信号在CCII组的天然B细胞中上调。
图5. CCI组TME中的B细胞和DC表现出增强的MHC I类抗原提呈途径
（A） CCI和CCII组中检测到的B细胞和DC细胞的比例。（B） CD141+CLEC9A+和pDC群体中与抗原呈递相关的基因的平均表达与其表达百分比的比较。（C）CD141+CLEC9A+和pDC群体中富集的前25个生物进程。（D）比较两组B细胞和DC中与抗原呈递过程相关基因的表达。t检验用于评估显著性（**：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.0001）。（E）两组间B细胞群体中识别的前60个DEG的分层聚类。
CCI和CCII组中NK细胞群分别占2.52%和0.85%（表S1）。比较免疫系统和反应KEGG通路相关的前50个DEGs，表明CCI组的大多数NK细胞表达更高水平的与激活的NK细胞功能正相关的标记基因，如KLRD1、KLRC1、GZMA、GZMB和NKG7（图6A）。TRAF4、FOSB、CXCL1和FOS等调节IL17和TNF信号的基因在CCII组的NK细胞中高表达。在2D-tSNE空间中显示表达活化NK细胞标记基因的细胞分布，表明GZMA，KLRC1，GZMB和NKG7仅在CCII组的少数NK细胞中表达（图6B）。CD7、IL2RB、CCL5和CCL4等与趋化因子和细胞因子信号传导相关的DEG在CCI组中高表达（图6C）。GSEA检测到“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”是CCI组中唯一富集的KEGG途径（图6D）。另一方面，在CCII组中检测到“ECM受体相互作用”和“局部粘附”通路的富集（补充表5）。就Hallmark通路而言，“INF-γ反应”和“同种异体排斥反应”是CCI组中唯一高度激活的两条通路，而EMT和“凝血”在CCII组中显著富集（补充图8A）。
然后我们分析了NK细胞的亚型，结果表明CCI组中成熟 NK和终末分化 NK细胞群体占比更高（图6E）。CCII组中CD56dimNK细胞和过渡NK细胞较多。根据轨迹分析，推断出两组NK细胞的发育情况，其中许多出现在早期假时间的细胞属于CCI组，同时也出现在两个分支上（图6F和补充表5）。我们共确定了七种状态，CCI组中检测到的成熟NK细胞比例较高（图6G）。终末分化NK细胞的比例在状态1中排第二位，然后在状态2和状态7中随着时间的推移而减少，而transitional NK细胞的比率增加。状态6主要由CD56bright和成熟NK细胞组成。与CCII组相比，CCI组除状态5外，活化NK细胞相关的基因表达均显著上调（图6H）。而成熟NK细胞由于状态1和状态2中ITGAT、ITGA1和BCL2上调，组织和细胞发育相关的KEGG通路被激活，如“局灶粘附”、“肌动蛋白细胞骨架调控”和“PI3K-Akt信号通路”。由此可见，在免疫应答方面，CCI组NK细胞相对于CCII组更活跃。
图6. CCII患者的TME中NK细胞的功能受到抑制
（A）CCI和CCII组NK细胞前50个DEG的分级聚类。（B）表达GZMA、GZMB、NKG7和KLRC1的NK细胞在2D tSNE空间中的分布。（C）趋化因子和细胞因子信号相关的基因的平均表达与表达百分比的比较。（D）CCI组中富集的自然杀伤细胞介导的细胞毒性途径的DEGs排名。（E）2D tSNE图显示了NK细胞亚型的分布，以及每个亚型在单个患者中的比例。（F）NK细胞的拟时间轨迹分析。（G）对七种状态沿着拟时间及其NK细胞亚型的组成进行了鉴定。（H）比较每种状态下标记基因的表达。
6. CCI和CCII患者的癌细胞表现出明显的异质性
与肿瘤进展相关的其他几种细胞类型，包括干细胞和上皮细胞被鉴定为群体最高（图1和补充表1和2），CCII组CSC的比例大幅增加至24.75%，而CCI组仅为15.63%。同样，CCII组的MSC人群比例更高（13.88%）。相比之下，CCII组的ADSC比例较低（3.13%）。选定标记基因的相对表达密度显示在2D tSNE空间中（图7A）。CSCs的前3个标记基因，包括CLDN10-AS1、AC024230.1和FYB2，也在上皮细胞中显示出一定的表达。CFTR、PROM1、CD55和RHEX在CCII组中CSC中显著上调，这意味着细胞生长水平较高（图7B）。与炎症反应相关的基因，如STAT1、ITGB4、SAT1和ANTXR1，以及一些胶原蛋白，在MSCs中表达高于其他干细胞。GSEA分析CCI组CSCs中富集的前6个通路与免疫应答相关，如“IFN-γ细胞免疫应答”、“IFN-γ介导的信号传导”和“B细胞介导的免疫途径” （图7C）。相反，与细胞生长相关的途径在CCII CSC中被高度激活。在CCII组的ADSC中，TGFβ和细胞外基质组织的信号似乎更丰富，而在CCI组的ADSCs中检测到离子膜转运的激活（图7D）。与多种癌症相关的信号传导是富含基底细胞和上皮细胞的TOP KEGG途径之一，前者中更倾向于“人瘤病毒感染” （图7E和F）。由于在四个非干细胞群体中，许多表达角蛋白和胶原蛋白的基因被检测为最高的DEGs，因此比较了这些基因的平均表达量及其表达率（图7G）。值得注意的是，在CCII组的这些细胞中，胶原蛋白的表达普遍上调，除了在淋巴内皮细胞中，也观察到角蛋白的表达。此外，胶原家族的几个成员在CCII组的多种细胞类型中上调，如COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A1、COL5A 2、COL6A1和COL18A1（补充图9A）。其中许多基因的异常表达与宫颈癌症的风险呈正相关，这意味着它们在临床诊断中具有潜在的应用价值。
图7. 肿瘤相关干细胞（TASC）和上皮细胞在CCI患者的TME中更具免疫反应活性
（A） 2D-tSNE图显示了癌症干细胞（CSC）、间充质干细胞（MSCs）、脂肪源性间充质干细胞（ADSC）和血管干细胞（VSC）的标记基因的表达密度。（B）热图比较了两组中每个干细胞样群体的前10个DEGs。分别富集CCI和CCII组的CSC（C）和ADSC（D）中前6个生物过程的GSEA（P值<0.05）。CCI组的基底细胞（E）和上皮细胞（F）中KEGG通路富集情况。（G）两组中角蛋白和胶原基因的平均表达与其表达百分比的比较。
7. 定量蛋白质组分析揭示CCII患者存在显著的免疫抑制
我们从CCI和CCII组中共鉴定出属于6181个蛋白质组的14855个蛋白质（补充表6）。PCA分析显示，PC1和PC2中CCI组和CCI组之间差异的覆盖率分别为55.0%和29.6%（补充图10A），两组的某些重复之间存在相对密切的相关性（补充图10B）。转录因子“HMG”下游73个蛋白被鉴定，其次是“zf-C2H2”和“Homeobox”（补充图10C和补充表7）。值得注意的是，鉴定了几种编码调节细胞发育的蛋白质的转录因子，如“MYB”、“CSD”和“ARID”，以及与免疫应答调节相关的转录因子，包括“STAT”、“IRF”和“NF-Y”。两组之间有541个差异表达蛋白（DEP）可被量化（图8A和补充表6）。CCII组中显著上调的DEP表现出高置信度的密集相互作用，AKT1（FC=1.91）是程度最高的节点，其与细胞外基质发育相关的其他几个高度节点相互作用，如FN1、MMP9、PXN、CAT和CUL1（图8C和补充表6）。MMP9与免疫应答相关的节点之间存在相互作用，例如CTSG、MPO、ELNE和AZU1。此外，与CTSG交互的下游节点包括SERPIN家族和IGFBP3的几个成员。CCI组上调的DEP之间的PPI显示出大量组蛋白（补充图10D）。几个调节线粒体相关代谢的节点相互作用，如CYC1、NDUFS1、NDUFS8和UQCRC1。重要的是，确定了三个与免疫反应相关的簇，它们分别由与抗原处理和呈递、应激反应和干扰素反应相关的蛋白质组成。
GSEA显示CCI组IFN-α（P-value = 2.2E-3）和IFN-β（P-value =1.5E-2）应答被富集，调控NF-κB的TNFα信号在CCII组中被富集（图8D）。然后，我们比较了通过snRNA-seq分析检测到的免疫细胞中IFN-α应答途径上检测到的DEP编码基因的表达，结果表明它们在MΦs、Treg、NK、B细胞和DC中表达更多，其中MΦs表达水平最高（图8E）。根据DEP和DEG的FC值评估蛋白质分布与细胞类型之间的相关性（补充图S11）。CSC与其他细胞类型在蛋白质组水平显示较低相关性。DEP与ADSCs的相关性最高（P-value <0.001），其次是NK细胞和MΦs（P-value <0.01）。CCII组中与免疫过程相关的前20个显著变化蛋白的FC值与不同免疫细胞群体中其基因的表达具有相关性（图8F和补充表7）。在CCII组的大多数细胞类型中S100A8和S100A9的表达上调，而在γδT细胞中CD55和PXN显著上调。总体而言，与CCI患者相比，CCII中形成了更多的免疫抑制性TME。
图8. CCI（n=3）和CCII（n=2）患者肿瘤组织的定量蛋白质组比较
（A）不同患者DEP含量（Z评分）的分层聚类。（B）火山图显示了CCII的前60个DEP。（C）CCII组DEP之间的蛋白-蛋白相互作用显著上调。（D）GSEA富集分析显示前8条Hallmark途径在两组中富集。（E）INF-α应答途径相关的DEP在不同免疫细胞中基因的表达谱。（F）CCII组中与免疫过程相关的前20个DEP的Log2FC值（在两组不同免疫细胞群体中的基因表达之间的相关性。
本研究使用snRNA-seq比较了I期和II期CC患者TME内的细胞异质性和功能。我们发现，CCI患者的MΦs表现出促炎功能，例如显著激活IFN-α和IFN-γ应答信号通路，而CCII患者的Mφs与细胞生长和组织发育相关的许多途径的激活密切相关。CD8+T细胞在CCI组中表现出更高的活性，而CCII组中Treg和γδT的数量显著减少。免疫应答，特别是MHC I类途径，在CCI组的DC和B细胞中更明显，而在CCII组中代谢和发育过程更丰富。与CCI组相比，CCII组NK细胞的比例降低了60%以上，CCI组中许多DEG的上调标志着NK细胞功能的激活。免疫应答相关途径在CCI组的几种干细胞类型中普遍被富集，而细胞和组织生长以及代谢途径在CCII组中高度存在。此外，定量蛋白质组学显示CCI组中IFN-α和IFN-γ反应信号的激活，这与snRNA-seq分析结果一致。
snRNA-seq分析显示，不同细胞类型中存在30多种胶原蛋白的显著上调。胶原蛋白是TME的主要成分，在癌症纤维化中发挥作用，并与受体、外泌体和microRNA相互作用，影响肿瘤细胞行为。此前已发现，与正常组织相比，CC组织中COL1A1的mRNA和蛋白质水平显著升高，并与放射敏感性呈负相关。COL6A1被认为是CC发生和发展的致癌基因，也是预后不良的预测因素。通过定量PCR检测到50 Gy剂量照射后残留CC中COL14A1的高表达。COL7A1和COL8A1被鉴定为与胶原组装相关的五个基因中的两个，可作为II期CC的单一组合预后标志物。提示COL10A1在CC进展中的作用。然而，其他胶原蛋白与CC之间的相关性及其在进展中的作用仍不清楚。我们发现新转录本AC244205.1是CCII组中许多细胞类型（如DC、MΦs、T细胞、MSCs、NPC和GMPC）中上调的DEG之一，这意味着它可能在CC的进展中发挥作用。最近的一项研究表明，在总体生存率更好的胆管癌患者中观察到AC244205.1的上调。然而，目前还没有关于AC244205.1在CC中的分子功能的报道，这将在我们未来的研究中进行研究。
CCII组的多种细胞类型中，与线粒体呼吸机制相关的DEG（如MT-CYB、MT-CO2、MT-CO3、MT-ND1、MT-ND2和MT-ND4）的表达均升高。这意味着呼吸链上细胞色素的激活，导致线粒体生物发生的水平升高，这可能是由于第二阶段肿瘤细胞生长相对于第一阶段的大量能量消耗。先前的一项研究表明，在小鼠模型上，线粒体复合物III的抑制，随后通过阿托伐醌影响线粒体呼吸，可以在体外和体内抑制某些CC细胞系的增殖并诱导凋亡。一些研究通过干扰某些信号通路（如mTOR和CaMKII/Parkin有丝分裂）而导致线粒体功能受损，以应对CC细胞系的代谢应激，抑制癌症细胞生长。我们的研究为干扰CC中上调的线粒体活性提供了更多的靶基因。
snRNA-seq分析发现，与CCI组相比，CCII组几乎所有免疫细胞都存在免疫抑制，这导致总体免疫抑制。IGLL5是CCII组MΦ中继胶原蛋白和线粒体基因后上调的DEG。最近根据TCGA数据显示，在透明细胞肾细胞癌中，它与肿瘤浸润免疫细胞（包括MΦs）密切相关。尽管IGLL5在乳腺癌TME中MΦs的作用尚不清楚，但IGLL5的被认为可以促进淋巴结的转移并在乳腺癌的发展中发挥作用。MMP11在CCII组MΦ中具有特异性。先前已提出MMP11在不同癌症中的免疫治疗作用。在癌症中，MMP11的表达被视为预后的生物标志物，并与CD68+巨噬细胞中的高CD68/（CD3+CD20）比率相关，这导致肿瘤中心的巨噬细胞极化，导致更高的转移表型。这意味着在CCII组的TME中可能发生类似的MMP11过程。
此外，CCL19、IL7R、SPARC、MGP、LUM和CXCR4在CCII组的MΦ和每个MΦ亚型中高度表达。CCL19的过度表达在CC细胞系和患者组织中发现，其通过siRNA的敲除通过凋亡途径抑制了体外CC细胞的增殖。SPARC与上皮间质转化相关，在预后不良的CC患者中过度表达。在hTERT mRNA表达升高的高级别宫颈癌前病变中，MGP显著增加。在CC组织中，LUM在大多数癌细胞和基质成纤维细胞中表达，表明其在CC生长或侵袭中的发挥作用。
尽管CCII组CD8+T细胞的数量较高，但与CCI组相比，其功能受到很大程度的抑制。CCI组的γδT细胞表达了许多干扰素诱导的基因和受体，而CCII组的γδT细胞数量很少。γδT细胞将先天性免疫与适应性免疫联系起来，以保护上皮免受创伤和感染，这被认为是HPV患者的潜在治疗方法。γδT细胞的数量与CC的进展呈负相关。γδT细胞单独可以抑制肿瘤生长，如果与galectin-1抗体联用，它们可以为CC提供更有效的免疫治疗。然而，肿瘤高表达的HPV16癌蛋白诱导了局部上皮相关γδT细胞亚群的重组，以促进血管生成和癌症的发展。因此，γδT细胞数量的显著减少可能与II期CC的高级别肿瘤发展密切相关。
与CCI组相比，CCII组的NK细胞数量显著减少，免疫反应也显著减少，CCI组“INF-γ反应”和“同种异体排斥反应”通路高度激活。CCII组中高度富集与细胞和组织发育相关的信号通路，可能与更活跃的肿瘤生长相关。CCII组中FBN1、FN1、SERPINE1、VCAN和许多胶原蛋白相关基因表达上调。先前的研究发现，胶原蛋白促进淋巴结包膜附近感染病灶中NK细胞的积累。因此，我们推测，NK细胞中高丰度的胶原蛋白可能是对CC II TME中极低NK细胞数量做出反应的细胞机制，以寻求招募更活跃的NK细胞。
蛋白质组学揭示了CCI和CCII组中不同的蛋白质谱。通过snRNA-seq分析，CCI组IFN-α和γ反应的激活与多种细胞，特别是免疫细胞类型的比较观察一致。CCII组DEPs上调与细胞外基质、细胞和组织发育及代谢密切相关，提示肿瘤发生程度更高。AKT1是相互作用程度最高的节点DEP。发现PI3K/AKT/mTOR的信号传导调节HPV阳性CC中的病毒-宿主细胞的交流，并且pAKT水平的升高与CC中的放疗抵抗相关。通过抑制AKT，随后破坏mTOR的信号传导，导致细胞死亡程度更高，并降低CC中的葡萄糖摄取。FN1是与CCII组中与多个DEPs相互作用并表达上调，显示其通过激活FAK信号通路促进CC的肿瘤发生。就CCI组中上调的DEP而言，存在一大簇组蛋白彼此强烈相互作用，包括H2A/H2B和H4成员，它们在转录、DNA复制和修复中发挥重要作用。经鉴定，组蛋白基因可作为CC患者生存预测的独立预后因素。这意味着其他组蛋白也可以作为标志物，与CCI组中上调的其他DEP（如HSP和干扰素应答相关蛋白）结合，用于CC早期检测。
在这项研究中，我们使用snRNA-seq和无标记定量蛋白质组分析对I期和II期CC患者的TME进行了比较研究。CCII期患者几乎所有免疫细胞，包括MΦs、T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞，都受到很大程度的调节，其表型具有显著的免疫抑制作用。相比之下，这些细胞在CCI期患者中显示出免疫反应增强，其中INF-α和γ反应是最活跃的信号通路。一些组蛋白显示出早期诊断CC的潜力。值得注意的是，对于CCII期患者，通过多种细胞类型的snRNA-seq分析和蛋白质组学分析分别鉴定出胶原蛋白的显著上调，表明它们可能被用作预后标志物。我们首次揭示了新转录本AC244205.1的异常表达与CCII期之间的相关性。这些发现为CC的临床诊断和免疫治疗提供了重要线索，值得进一步研究。
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